详细内容
产品名称：组化双染试剂盒
产品规格：50T
储存温度：-20℃ , 一年有效
本产品仅限于业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
原理：
一抗识别抗原，HRP标记二抗识别一抗，HRP催化中间体TY永久性标记抗原且实现信号放大，红色色原特异性识别TY产物（共价结合），从而实现了红色信号的累积，完成了红色显色.常规免疫组化染色用DAB，形成棕色物质。DAB棕色+红色，形成了独特的组化双染颜色，该组化双染信号可以中性树胶封片，不同于传统的碱性磷酸酶AEC或AP-red等红色信号（不能中性树胶封片）。
操作步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min——二甲苯Ⅱ15min——无水乙醇Ⅰ5min——无水乙醇Ⅱ5min——85%酒精5min——75%酒精5min——蒸馏水洗。
2.抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；也可以用其他抗原修复方式，比如：95°C水浴25min或者高压等。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4.BSA/封闭液封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一抗说明书推荐比例配好的指标一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6.加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
7.DAB显色：将DAB与DAB buffer按1：100配制成工作液，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8.抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原第二次修复。中火8min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。也可以用其他抗原修复方式，比如：95°C水浴25min或者高压等。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
9.BSA/封闭液封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（加固防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
10.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一抗说明书推荐比例配好的第二指标一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
11.加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
12.红色显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加解冻的TY反应液反应20min，PBS洗三次，之后加入红色显色液工作液(PB:CU:红色色原:AC=860:40:1:100)反应15min，显微镜下可控制显色时间，阳性为红色，自来水冲洗切片终止显色。
13.复染细胞核：用苏木素#abs9214复染细胞核。
14.脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min——85%酒精6min——无水乙醇Ⅰ6min——无水乙醇Ⅱ6min——二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
15.显微镜镜检，图像采集分析。
16.石蜡切片免疫组化结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，指标DAB显出的阳性表达为棕黄色，第二指标红色显色的阳性表达为红色或粉红色。
注意事项：
1.DAB显色尽量不要过深，过深会影响红色显色结果。
2.双染的两个抗原尽量表达位置不同（如标记不同细胞或者不同表达位置），不适用于两个抗原的共定位（不同于荧光的共定位）。
3.红色显色抗原所对应的一抗抗体浓度适当提高一些，组化二抗应使用高敏多聚二抗。
4.可以标红色，第二标棕色。
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